注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

植物叶绿素广泛存在于绿色植物组织中，其含量与光合作用、营养状况密切相关，是反应植物生长状况的重要指标。

测定原理

叶绿素a和叶绿素b在645nm和663nm处有最大吸收，根据经验公式可计算得叶绿素a和叶绿素b以及总叶绿素含量。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、10mL玻璃试管、锡箔纸、丙酮。

试剂组成和配制

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。

测定操作

称取约新鲜植物叶片或其它绿色组织，去掉中脉，称取约0.1g，剪碎，用蒸馏水洗干净。

提取液的准备：取240mL蒸馏水和960mL丙酮，充分混匀待用。

加入1mL蒸馏水，少量试剂一（约50mg），在黑暗或弱光条件下充分研磨，转入10mL玻璃试管。

用提取液冲洗研钵，将所有冲洗液转入玻璃试管，用提取液补充至10mL，玻璃试管置于黑暗条件下或者包上锡箔纸浸提3h，观察试管底部组织残渣完全变白则提取完全，若组织残渣未完全变白，继续浸提至其完全变白。

取浸提液200μL于微量石英比色皿/96孔板，提取液调零，测定663nm和645nm处吸光值，分别记为A663和A645 。

计算公式

叶绿素a含量（mg/g 鲜重）=（12.7× A663 – 2.69 × A645）×V提×D÷m÷1000

= 0.01×（12.7× A663 – 2.69 × A645）×D÷m

叶绿素b含量（mg/g 鲜重）=（22.9× A645 – 4.68 × A663）×V提×D÷m÷1000

= 0.01×（22.9× A645 – 4.68 × A663）×D÷m

叶绿素总含量（mg/g 鲜重）=（20.21× A645 +8.02 × A663）×V提×D÷m÷1000

= 0.01×（20.21× A645 +8.02 × A663）×D÷m

V提：提取液体积，10mL；D：稀释倍数；m：样本质量，g

注意事项

叶绿素对光敏感，研磨和提取等操作尽量避光或者在弱光下进行。

一定要浸提至组织残渣完全变白，否则提取不充分。

用提取液冲洗研钵一定要冲洗至所有的绿色物质被转移至玻璃试管。

测定时吸光值超过1，可进行适当稀释。