1、 IHC- 石蜡技术指南 (IHC-P)

免疫组织化学 (IHC) 是确定组织切片上蛋白的存在与否及存在位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法 或 ELISA 等免疫测定方法低，但是它能观察到整个组织的情况。适用于评估癌症等疾病的发展及治疗情况。因此，从 IHC 获得的  信息结合显微技术提供 了一副 “宏图”，使来自其它方法的数据有据可依。

免疫组织化学染色是抗体识别靶抗原的过程。因为抗体是高度特异的，因此它只与组织切片上相应的蛋白结合。应用显色检测法 即能看到抗原 - 抗体反应，一种显色方法是将与酶结合的抗体作为底物在蛋白位点产生一种色素沉着，另外一种方法是荧光检测 法，即将荧光染料结合到抗体上，应用荧光显微技术检测。

IHC-P 涉及到固定（通常在中性甲醛溶液中固定）组织的染色，然后是在切割之前的石

蜡包埋。下面是 IHC-P 技术的基本步骤：

1. 组织的固定和包埋

2. 切割并封固切片

3. 脱蜡复水

4. 抗原修复

5. 免疫组织化学染色

6. 复染（如果需要）

7. 脱水并用封固剂封固

8. 显微镜下观察染色

     免疫组织化学染色

优化 IHC-P 新抗体

一种新抗体要应用到 IHC-P 中，就必须找到适宜这种抗体的染色条件。每种抗原都有一个最佳修复方法。每种抗体都有一个最佳 稀释浓度。

抗原修复

试着在没有抗原修复和应用下列抗原修复方法修复抗原的情况下染色，详细操作见抗原修复部分（第 30 页）。

1. 热修复：枸橼酸钠 10 mM ，pH 6.0

2. 热修复：Tris/EDTA pH 9.0

3. 酶解：胰蛋白酶、胃蛋白酶或其它蛋白酶。

抗原修复的最佳方法确定后，就可以进行最佳抗体浓度的确定了。 一抗浓度

如果抗体浓度未知，我们建议用 0.5 μg/ml 和 5 μg/ml 4°C 过夜。如果抗体未经纯化，我们建议开始时使用下面的初始稀释度， 也可以尝试 20 倍的高倍稀释度。

1. 全抗血清：1/50

2. 腹腔积液：1/100

3. 组织培养上清：不稀释（也指  “neat”） 检测

我们建议使用辣根过氧化物酶 (HRP)，在光学显微镜下观察。过氧化物 /DAB 作为底物和色素原。荧光显微镜方法中有多种荧光 染料标记的 抗体，具体用哪一种要根据试验需要来进行选择。

固定

正确的固定是免疫组织化学方法的关键。最常用的是 10% 中性甲醛溶液 (NBF)。启研 说明书推荐 IHC-P 使用该固定剂，除非   另有说明。其它不常用的固定剂如多聚甲醛 (PFA)或 Bouin's 液（甲醛 / 苦味酸）等。这些固定剂的配方详见缓冲液部分，第 71 页。

理想的固定时间取决于组织块的大小和类型。对于大多数组织来说，通常固定时间在 18-24 小时之间较为理想。固定不足会导致 组织切片因边缘染色而信号强，中间未染上而无信号。固定过度将会屏蔽抗原表位。抗原修复有助于克服屏蔽作用，但是如果固 定时间太长（比如一个星期）那么抗原修复也无济于事。

固定后，将组织块包埋于石蜡中，用切片机切成理想厚度（依据组织一般大约在 5-20 微米），然后将切片附着在玻片上，封固  最好用正电荷吸附或 3- 氨基 - 丙酯 - 三 - 乙氧基 - 硅烷 (APES) ，室温过夜脱水并彻底干燥。如果切片不能很好的附着在玻片上， 可以将其至于 60°C 放置数小时。

脱蜡

在开始染色之前，切片必须先脱蜡至水。脱蜡不彻底，就会使切片很难染上色。

材料及试剂 • 二甲苯

• 无水乙醇  • 95% 乙醇 方法

将切片置于架子上，依据下列方法冲洗：

1. 二甲苯：2 X 3 分钟

2. 二甲苯与无水乙醇 1:1 混匀：3 分钟

3. 无水乙醇：2 X 3 分钟

4. 95% 乙醇：3 分钟

5. 70 % 乙醇：3 分钟

6.50 % 乙醇 : ：3 分钟

7. 冷的自来水小水流冲洗

在开始抗原修复前确保切片一直浸没在水中以防变干，否则特异抗体不易结合且会有很高的染色背景。

抗原修复

大多数甲醛固定的组织在开始染色之前都需要先修复抗原，这是由于在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联屏蔽了抗原位点。 两种抗原修复方法为热修复法（称之为热诱导抗原表位修复或 HIER）和酶解法。

这些修复方法原理都是将亚甲基桥打断，使抗原表位暴露出来，以便于抗体结合。有的抗原适合酶解修复，有的抗原适合热修复。 酶解修复有时会损坏组织的形态结构，因此需要摸索酶浓度和作用时间。Tris/EDTA pH 9.0 的缓冲液适合于大多数抗原，pH 6.0 的  枸橼酸钠缓冲液也较为常用。以下网站解释了为什么 启研 建议首选 Tris/EDTA pH 9.0 的缓冲液而不是 pH 6.0 的枸橼酸钠缓冲液。 www.nordiqc.org/Techniques/Epitope_retrieval.htm

热抗原修复需要高压锅、微波炉或蒸煮锅。另外， 一些实验室将玻片置于修复溶液中 60°C 水浴过夜。除非抗原修复方法在抗体 数据表中可以找到，否则必须通过实验来确定适宜的修复。启研 建议尝试多种方法来确定适宜的修复方法，以便于获得理想的 染色。

1. 热修复缓冲溶液

下面是三种 HIER 较为常用的缓冲溶液，对于一个特定的抗体，在没有其他研究者建议的情况下，要通过实验确定选用哪种修复缓冲液。

1. 枸橼酸钠缓冲液 (10 mM Sodium Citrate, 0.05% 吐温 - 20, pH 6.0)

2. 1 mM EDTA, 调至 pH 8.0

3.Tris/EDTA 缓冲液 (10mMTris, 1 mM EDTA 溶液 , 0.05% 吐温 -20, pH 9.0)

2. 热修复法

a) 高压蒸汽法

玻片要置于金属架上

材料及试剂

• 家用不锈钢高压锅 • 加热板

• 玻片架放置容器（容量大约 400-500ml）

• 抗原修复缓冲液（如 Tris/EDTA pH 9.0，枸橼酸钠 pH 6.0） 方法

1. 将合适的抗原修复缓冲液加入高压锅内，然后将锅置于加热板并开至最大功率，此时不要把盖子盖紧。在等待煮沸过程中，按前 面描述进行脱蜡至水。

2. 煮沸后，将玻片从自来水中取出放入高压锅内。小心热溶液 - 使用镊子。依照说明书加上加压阀。

3. 高压锅达到最大压力后（见操作手册），维持 3 分钟（见注意事项 1）。

4. 3 分钟过后，关掉加热板，将高压锅取下放置。

5. 打开高压锅阀门（见操作手册），冷水冷却锅身。压力降下后，打开锅盖，冷水冷却 10 分钟。小心热溶液使用注意事项（见注 意事项 2)。

6. 参照手册继续染色。

注意事项：

1. 3 分钟只是抗原修复的建议时间。低于 3 分钟可能会使修复不彻底，导致染色较弱。而超过 3 分钟可能会使修复过度，导致非特 异性背景染色，同时增加切片离解的几率。因此需要做对照试验，同样的组织切片分别修复 1、2、3、4、5 分钟后开始染色，针 对所用的特异抗体选择最佳修复时间。

2. 确保玻片彻底冷却可以便于下一步操作，而且使抗原表位在经历高温后复原。

b) 微波法

不建议使用家用微波炉。因为它会导致抗原修复时冷热不均。而且由于没有高压环境，修复时间较长，会使切片解离。建议使用科 研专用微波炉较为合适。大多品牌的科研专用微波炉都有加压装置，能持续保持 98°C 从而避免切片解离。唯一的缺陷就是它的 价格昂贵。

使用该方法时，修复缓冲液煮沸会大量蒸发，要确保缓冲液的量，不能使切片变干。

材料和试剂

• 家用 (850W) 或科研专用微波炉

• 微波炉专用玻片放置架及容器（容量大约 400-500ml）或染色缸

• 抗原修复缓冲液（如 Tris/EDTA pH 9.0，枸橼酸钠溶液 pH 6.0，等等）

方法

1. 按前面描述将切片脱蜡至水。

2. 向微波炉专用容器中加入合适的修复缓冲液（见注意事项 1）

3. 从自来水中取出切片并放入容器中，置于微波炉内。如果用家用微波炉，就将之开到最大功率至开始沸腾并煮沸 20 分钟。如 果采用科研专用微波炉，就将温度设置在 98°C 维持 20 分钟以修复抗原（见注意事项 2）。

4. 20 分钟后，取出容器放置水中冷却 10 分钟。小心热溶液（见注意事项 3）。

5. 参照手册继续染色。

注意事项

1. 使用非密封的容器，要确保修复缓冲液足以浸没切片几厘米，防止在煮沸过程中切片变干。

2. 20 分钟只是抗原修复的建议时间。低于 20 分钟可能会使修复不彻底，导致染色较弱。而超过 20 分钟可能会使修复过度，导  致非特异性的背景染色，同时会增加组织切片从玻片上解离的几率。因此需要做对照试验，同样的组织切片分别修复 5、10、15、

20、25、30 分钟 后开始染色，针对特异抗体选择最佳修复时间。

3. 确保玻片彻底冷却可以便于下一部操作，而且使抗原表位在经历高温后复原。

c) 蒸煮锅法

许多实验室使用蒸煮锅或电饭煲加热。此方法与微波法相似，都是将缓冲液温度维持在 100°C，不同之处在于沸腾时此方法没 有微波法反应激烈。该方法也可用 100°C 水浴代替。

材料和试剂 • 蒸煮锅

• 玻片放置架及容器（容量大约 400-500ml，如果采用 Tissue –Tek 容器大约 250ml）

• 抗原修复缓冲液（如 Tris/EDTA pH 9.0，枸橼酸钠溶液 pH 6.0，等等） 方法

1. 按前面描述将切片脱蜡至水。

2. 依据用户手册设置蒸煮锅并预热。

3. 在烧瓶中加热适量修复缓冲液并煮沸（用微波炉加热会更方便）。

4. 将盛放玻片架的容器放置蒸煮锅中。

5. 将热修复缓冲液小心加到容器中，然后放入玻片架。也可以采用更简捷的操作，先向容器中加热修复缓冲液再放入蒸煮锅中。

6. 加盖。盛放缓冲液的容器也须配备盖子。刚开始时玻片架可能会使修复溶液温度降低，但几分钟内会回升到 95-100°C 之间。

7. 达到温度后维持 20 分钟。（见微波法注意事项 1）

8.20 分钟后，取出容器放置水中冷却 10 分钟。热溶液使用注意事项（见微波法注意事项 2)。

3. 酶解抗原修复法

依据抗体数据表中选择需要的酶。如果没有，那么胰蛋白酶适用于大多数福尔马林 /PFA 固定后需要修复的抗原。

至少有两种将酶溶液加到组织上的方法：直接用吸管将酶溶液滴加到玻片的组织上或将组织玻片放入酶溶液中。第一种方法反应试 剂需要量少，但是因为每个玻片需要分别处理，较不容易保证孵育时间的一致。鉴于此，在处理大批量玻片（如数量 >5）时，采 用第二种方法较容易。如果采用全自动染色系统（如 Ventana），要查阅酶解修复操作指南。

a) 滴管法   材料和试剂

• 37°C 孵育箱

• 加湿器（恒温箱自带或在容器内放入湿纸巾）

• 两个盛 TBS 的玻片架容器（TBS 配方详见缓冲液部分第 71 页）

• 酶解抗原修复溶液（胰蛋白酶如下所述，胃蛋白酶和蛋白酶 K 见缓冲液部分第 71 页）

下面介绍一下胰蛋白酶法。有市售已优化的 IHC 用胰蛋白酶产品 (启研，货号 ID ab970)，也可以按照第 11 章 71 页缓冲液部 分制备。

方法

1. 将胰蛋白酶预热至 37°C。小心的将组织切片周围的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上（一般 50-100μl 即可）。用吸管尖 端将酶溶液铺盖住整个切片，注意不要弄坏组织。

2. 将玻片置于加湿器内，然后 37°C 孵育。避免直接将玻片放入恒温箱架子上，否则会因温度不均影响染色质量。盛放玻片的容 器最好先预热再放入恒温箱内。

3. 10-20 分钟（需要优化）后，取出玻片，流水冲洗 3 分钟。

4. 参照手册继续染色。

b) 浸泡法   材料和试剂

• 37°C 水浴

• 玻片架及玻片架容器

• 酶解抗原修复溶液（胰蛋白酶见滴加作用液法，胃蛋白酶和蛋白酶 K 见缓冲液部分第 71 页）

方法

1. 将水浴温度设置为酶最适宜的温度。向盛放玻片架的两个容器中加入超纯水。容器放入水浴中加热。（见注意事项 2）

2. 按上述方法将切片脱蜡至水后放入水浴箱其中一个容器中加热。（见注意事项 3）

3. 用水浴箱中另一个容器中的热水制备酶解抗原修复缓冲液，然后将盛有缓冲液的容器放回水浴箱中重新加热。（见注意事项 4）

4. 将加热过的玻片放入酶溶液中 10-20 分钟（见注意事项 5）并间歇缓慢震荡。取出玻片在流水下冲洗 3 分钟，将酶漂洗干净。

5. 参照手册继续染色。

注意事项

1. 仔细阅读酶使用手册，因为有些酶需要特殊的缓冲溶液和活性辅助因子。

2. 水或缓冲液的体积要足够没过玻片。

3. 若将冷玻片直接放入酶溶液中会使溶液温度降低从而酶活性降低，导致抗原位点修复不彻底。

4. 尽可能快的准备出抗原修复缓冲液以避免妨碍酶活性的发挥。放入玻片之前使溶液达到需要的温度。

5. 10-20 分钟只是孵育的建议时间。低于 10 分钟可能会使修复不彻底，导致染色较弱。而超过 20 分钟可能会使修复过度，导致非  特异性背景染色，增加切片从玻片上解离的几率，损坏组织形态。因此需要先做对照试验，同样的组织切片分别孵育 10、15、20、25、30 分钟后开始染色，针对特异抗体寻找到最佳修复时间。

                  免疫组织化学染色和检测实验方案

1. 一般原则

下面的操作适用于没有全自动染色机或 capillary gap system 等的实验室（如 Shandon Sequenza）。可用吸管人工加试剂， 该手册也适用于全自动或半自动系统。

培养箱应配备有加湿器避免组织变干。变干发生在任何阶段最后都会导致非特异性染色及高背景染色。带密封盖的浅塑料盒，底 部铺上湿纸巾就是一个加湿装置。玻片只要不贴聚纸巾且平放就不会变干，一个好的解决办法就是，将一根塑料输液管切割成若 干适合恒温箱的小段，用胶两个两个的粘到恒温箱底部，每对管之间间隔 4cm，这样能给玻片一个平稳及升起的小平台，使玻 片直接接触湿纸巾。

一抗和二抗的最佳稀释度可以从数据表中找到，或者通过试验获得。根据所获得的结果调节至最佳稀释度。要严格遵照说明书中 的孵育时间。

酶解法中，辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 是最为常用的酶。这些酶有许多底物。

2. 操作步骤

缓冲液配方请参照 11 章第 71 页。若需要可在开始下面操作之前先进行抗原修复。 第一天

1. 如使用 HRP 标记二抗检测，则需要封闭掉内源性过氧化物酶，但我们建议在开始一抗孵育前不予理会。

2. 在含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗玻片 2 X 5 分钟，轻轻震荡。

3. 用含 10% 正常血清、1% BSA 的 TBS 室温封闭 2 小时。空干封闭液（不是漂洗），并用纸巾将玻片周围擦干。

4. 一抗用含 1% BSA 的 TBS 稀释后加到玻片上。

5. 4°C 孵育过夜。 第二天

1. 用含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗 2 X 5 分钟，并轻轻震荡。

2. 如使用 HRP 标记二抗检测，则需将玻片在含 0.3% H2O2 的 TBS 中孵育 15 分钟 以封闭内源性过氧化物酶。

3. 酶法检测（HRP 或 AP 标记二抗）：

参照厂家推荐的稀释度，用含 1% BSA 的 TBS 稀释酶标二抗，加到玻片上后室温孵育 1 小时。

荧光检测：

参照厂家推荐的稀释度，用含 1% BSA 的 TBS 稀释荧光标记的二抗，加到玻片上后室温孵育 1 小时。

4. 在 TBS 中漂洗 3 X 5 分钟。

如采用荧光检测，则结束此步后就可以用封固剂和盖玻片进行封固了。 如采用底物显色，则还需继续进行下述操作。

5. 室温下与底物作用 10 分钟。

6. 流水冲洗 5 分钟。

7. 复染（如果需要）。

8. 脱水，擦干并封固。

3. 对照

为了评价非特异性交叉反应和 Fc 受体结合的影响，与一抗同型但不相关的抗体（如 BrdU）将来用做对照。与不相关抗原结合的 抗体称为同型对照。对于全血清抗体而言，对照抗体是来源于同种动物的未免疫正常血清。

如果没有同型对照，阴性对照也可，就是用抗体稀释液代替一抗。强力推荐阳性组织对照，确保抗体达到预期效果。根据实验需 要，也可设阴性组织对照，在该组织中应没有目标蛋白存在的。

                       注意事项：

1. 二抗可能会与组织内的内源性免疫球蛋白发生交叉反应。以二抗同种动物来源的正常血清预处理组织，可减少这种作用。加一抗 前先与正常血清孵育从而消除 Fc 受体与一抗和二抗结合。抗体稀释缓冲液中的 BSA 能降低疏水作用引起的非特异结合。

如果组织样品经醛类如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等固定后用免疫荧光法 (IF) 检测，在加一抗之前要用含 0.3M 甘氨酸的封闭液封闭。 因为甘氨酸能结合自由醛基，否则这些醛基会与一抗和二抗结合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定时，由自由醛基导致   的高背景很有可能发生。

2. 一抗应稀释到厂家推荐的最佳稀释度或者曾经筛选到的最佳稀释度。如果没有起始稀释倍数，我们建议按下述操作。大多数 IHC-P   用抗体的使用浓度在 0.5-10μg/ml 之间。要确保一抗和被染色的组织来自不同物种。例如，小鼠组织， 一抗来自小鼠，抗鼠[ 相关下载 ]