免疫沉淀是一种纯化蛋白质的方法。将我们感兴趣的一种蛋白质的抗体与细胞提取液孵育，以使抗体和蛋白质在溶液中结合。 然后用蛋白 A/G 耦合的琼脂糖凝胶，从样品中将抗体 / 抗原复合物提取出来。这种物理方法可将所需蛋白质从样品中分离出来。 然后样品可以通过 SDS-PAGE 分离出来进行 Western blot 分析。

1.a 裂解缓冲液

理想的裂解液将保留蛋白质的天然构象，将抗体结合位点变性减到最少，同时从样本中释放足够量的蛋白质，以满足接下来  的分析。非离子型去污剂比如 NP - 40 和 Triton X-100 比离子型去污剂如 SDS 和脱氧胆酸钠要温和一些。其它可以影响到 IP 成功的  因素包括盐浓度、二价阳离子浓度和 pH 值。因此，要按如下范围优化这些变量（摘自Harlow and Lane，231 页，见参考部分 67 页）：

• 0-1 M 盐

• 0.1-2％ 去污剂，非离子型

• 0.01-0.5％ 去污剂，离子型

• 0-10 mM 二价阳离子

• 0-5 mM EDTA

• pH 值：6-9

各种裂解液配方可以参考缓冲液部分：第 11 章，第 71 页。

变性裂解液

用于去污剂可溶性抗原，并且抗体可识别其天然构象。

1. RIPA（放射免疫沉淀法）缓冲液

比裂解液 NP - 40 或 Triton X -100 更能使蛋白质变性，RIPA 缓冲液含有离子型去污剂 SDS 和脱氧胆酸钠作为活性成分，对裂解 核膜进行核内提取特别有用。RIPA 缓冲液可以降低背景，但同时可使某些蛋白变性，包括蛋白激酶。

2. 不含去污剂的可溶性蛋 白裂解液

使用含 EDTA 和叠氮钠的 PBS。有些可溶性蛋白不需要使用去污剂。对细胞使用此缓冲液并加上机械破损，例如反复通过注射器或 用 Dounce 匀浆器匀浆。

3. 变性裂解液或用于不溶性抗原缓冲液的去污剂

天然蛋白质的抗原表位总是不容易靠近只识别变性蛋白质的抗体。当收集和裂解细胞时，用变性裂解液加热细胞。这个方法也可用 于非离子型去污剂不能从细胞中提取的抗原。用 DNase1 将有助于从染色质中提取蛋白质。

1.b 其他试剂

蛋 白酶抑制剂

一旦裂解发生，水解、去磷酸化和变性就开始了。如果样本在冰上或始终在 4°C 存放以及一开始就往裂解液中加入适当抑制剂的话， 这些反应将可以大大减缓。混合（“鸡尾酒”）的蛋白酶和磷酸酶抑制剂已经商品化了。如果不使用混合的蛋白酶抑制剂，IP 实验  中最常用的两种蛋白酶抑制剂是 PMSF（50μg/ml）和抑肽酶（1μg/ml）。磷酸酶和蛋白酶抑制剂的详细资料，请参阅我们的蛋  白质免疫印迹实验指南。所需的其他试剂：

• 无菌 PBS pH 值 7.4

• 无菌 PBS- 牛血清白蛋白 1％ W/ V（过滤）

• TBST 缓冲液

• 蛋白免疫印迹实验的加样 / 样品缓冲液

• 100 mM EDTA 贮备液：1.86g EDTA 溶解到 40ml 水中。加氢氧化钠调整 pH 至 7.4。最后定容到 50ml。

2.裂解物制备 

培养细胞的裂解 非变性：

1. 将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。

2. 吸干 PBS 后，再加入冰冷的裂解液（每 107 细胞 /100mm2  培养皿 /150cm2  培养瓶加 1ml，每 5x106 细胞 /60mm2  培养皿 /75cm2  培养瓶加 0.5ml）。

3. 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的 EP 管中。

4. 4°C 持续振荡 30 分钟。

5. 放入微型离心机 4°C 离心。

您可能要根据细胞的类型更改离心力和时间。一个准则就是 12,000rpm 20 分钟，但是这必须由最终用户决定（如白细胞需要轻 度离心）。

6. 从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀

变性：

1. 加 100μl 变性裂解液至 0.5-2 × 107 个细胞中。

2. 用涡旋混合器最大速度剧烈震荡 2-3 秒。将细胞悬液转入 EP 管。

3. 样品加热 95°C 5 分钟变性。

4. 用 0.9 ml 非变性裂解液稀释悬液 , 轻轻混合。（非变性裂解液中过量 1％ Triton X – 100 可以淬灭原来变性缓冲液中的 SDS）。

5. 将裂解的悬液通过 1ml 注射器针头 5-10 次，把 DNA 打成片段。

6. 冰上孵育 5 分钟。

7. 进行免疫沉淀反应。

组织裂解

1. 用干净器械解剖所要的组织，最好在冰上，并快速操作以防止蛋白酶降解。

2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮中“速冻”。样本在 -80°C 储存备以后使用或放在冰上立即匀浆。

3. 对于约 5mg 组织，向管中迅速加入约 300μl 裂解液并用电动匀浆器均浆。

4. 裂解液冲洗刀片两次，每次 300μl，然后 4°C 持续振荡 2 小时（将回旋振荡器放入冰箱）。

裂解液的体积根据组织总量来决定。蛋白提取物不宜过于稀释，以避免蛋白质损失，并尽量减少样品体积以便凝胶上样。最小浓度 为 0.1mg/ml；最佳浓度为 1-5mg/ml。

5. 微型离心机 4°C 12000rpm 离心 20 分钟。从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。吸出上清液放入预冷的新管（放在冰上）中， 弃沉淀。

3.裂解物的预清除程序

裂解物预清除可以帮助减少蛋白质非特异性结合到 agarose ( 琼脂糖 ) 或 Sepharose beads ( 凝胶琼脂糖珠 )。用无关抗体 或血清预清除，可去除蛋白质与免疫球蛋白的非特异结合。最终实验结果背景降低并且信噪比提高。但是，如果最后蛋白质是由免 疫印迹实验检测，预清除未必必要，除非是污染蛋白质对目的蛋白质产生明显干扰。

1. 加入50μl 同种动物来源和型的无关抗体或正常血清作为免疫沉淀抗体（一些研究人员首选兔，参考 Harlow and Lane ，243 页） 到 1ml 裂解物中，在冰上孵育 1 小时。

2 加入 100μl 珠浆。

3. 4°C 孵育 10-30 分钟并轻轻搅拌。

4. 微型离心机 14000g 4°C 离心 10 分钟。

5. 丢弃珠子并保留上清进行免疫沉淀。

为了提高收率，珠子可用裂解液洗涤 1 或 2 次以上，并将上清收集在一起。

重要的是要确保尽可能多的去除正常血清，这是因为它会与特异抗体竞争靶抗原。为了检查这一点，可以做一个测试：用裂解 缓冲液代替样品，如上进行所有预清除步骤。考马斯蓝染色的凝胶将显示上清液中血清 IgG 是否被有效去除。如果血清没有得到充 分去除，泳带将出现在 50 和 25 kDa 处，这是重链和轻链，它的存在可能导致一个弱的免疫沉淀反应。在预清除步骤，考虑降低 血清量或增加与您的样品孵育的珠子数量。

4.免疫沉淀

1. 在冰上预冷离心管中加入 10-50μg 含推荐量抗体的细胞裂解物。具体数量将根据蛋白质的丰度和抗体与蛋白质的亲和力来选择。 通常在预实验中，通过增加抗体的量沉淀固定数量的蛋白质。

您可以查看抗体数据表获得建议抗体的浓度。以下供参考使用：

• 1-5μl 多克隆抗体血清

• 1μg 亲和纯化的多克隆抗体

• 0.2-1μl 腹水（单克隆抗体）

• 20-100μl 培养液上清（单克隆抗体）

2.样品和抗体孵育的固定时间 4°C 1-12 小时（过夜），最好轻轻振荡或旋转。孵育时间的长短取决于蛋白质的量和抗体的亲和特性。

3. 同时准备琼脂糖珠子。如果使用单克隆抗体，选择蛋白G 偶联琼脂糖珠子。如果使用多克隆抗体，蛋白A 偶联琼脂糖珠通常是 适合的（请参阅“选择蛋白珠”表 9.5 下文）。如果买来的珠子是粉末，100mg 的珠子与 1ml 0.1M PBS 孵育，洗 1 小时后珠子膨 胀起来，然后离心，去除上清。加入 1ml 含 0.1％ BSA ( 牛血清白蛋白) PBS，混合 1 小时，PBS 洗涤 2 次。去除上清并加入 400μl 含蛋白酶抑制剂的缓冲液（可与裂解液相同）就可以使用了。它可以在 4°C 储存几天；在含 0.02％ 叠氮钠的 PBS 里会保存更长 时间（使用当天用新鲜裂解液充分洗涤珠子）。您也可以购买事先膨胀好的珠子直接使用。

4. 浆料混合好，向每个样本中加入 70-100μl。始终保持样品在冰上。珠子将倾向于粘着吸头，所以尽量减少珠子在吸管中运动并使 用从尖端切断 5mm 的吸头。

5. 裂解珠子混合液 4°C 孵育 4 小时并旋转振荡（最佳孵育时间可由预实验确定）。

6. 当孵育结束后，管子离心，去除上清液并用细胞裂解液洗涤珠子 3 次（每次 4°C 离心去除上清）。

7. 最后，去除最后一次上清并加入 25-50μl 2× 上样缓冲液。95-100°C 煮沸 5 分钟，以变性蛋白质并将其与蛋白- A /G 珠子分离， 随后离心并保持上清含有蛋白质。然后，您可以冻存样品或进行 SDS – PAGE 电泳。

使用上样缓冲液是最苛刻的洗脱方法，也将洗脱任何非共价结合的抗体和抗体片段，这将显示在免疫印迹胶中。 抗原可用温和的甘氨酸梯度洗脱（高达 1M），以减少抗体洗脱量。请同时参阅抗体交联琼脂糖凝胶分离程序。

5.选择合适的微珠，汇总表

Key: +++ = Strong binding, ++ = Medium binding, + = Weak binding, - = No binding

参考资料

Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1-8.3.28,New York: John Wiley, 2001.

6.使抗体与微珠交联的步骤：

降低洗脱蛋白质溶液中污染的抗体数量：

为了使洗脱蛋白较少污染抗体，也为了更纯净蛋白质的制备和干净的免疫印迹实验，推荐将抗体与珠子交联。下面是一个实验程序 举例（几个网站有关于这个程序有很多信息）。目标蛋白应该用温和的洗脱液洗脱，如甘氨酸缓冲液。更详细的缓冲液配方可在缓 冲液章节找到，第 71 页。

试剂：

交联试剂：

邻苯二甲酸二甲酯（DMP） 储液浓度 13mg/ml

洗脱试剂：

1M 甘氨酸（加浓盐酸调整 pH 值至 3） 稀释缓冲液：

PBS+ 1mg BSA [ 相关下载 ]