正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

高铁还原酶（ferric-chelate reductase, FCR）催化高价铁螯合物中的Fe3+还原为Fe2+，在部分物种铁元素的吸收中有重要作用。

测定原理：

FCR催化Fe3+还原为Fe2+，Fe2+和ferrozine反应显色，在562nm下有特征吸光值。

自备用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体6mL×1瓶，4℃避光保存;

试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存;

试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：水（mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL蒸馏水），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至562nm，蒸馏水调零。

工作液配制：将试剂一、二、三以1:1:1的比例混合。临用前配制，用多少配多少。

在微量石英比色皿/96孔板中，加入50μL样本上清和150μL工作液，混匀，记录初始吸光值A1和30min后的吸光值A2。ΔA=A2-A1。

FCR活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 8.0014x + 0.0011，R2 = 0.9997；

按样本质量计算

单位定义：每g样本每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。

FCR（nmol/min/g 鲜重）=（△A-0.0011）÷ 8.0014×1000×V标÷(V样÷V样总×W)÷T

= 4.166×（△A-0.0011）÷W

按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg蛋白每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。

FCR（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0011）÷8.0014×1000×V标÷(V样÷V样总×Cpr)÷T

=4.166×（△A-0.0011）÷Cpr

V样总：加入提取液体积，1 mL；V样：反应中样品体积，50μL；V标：加入标准品体积 ，50μL；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；1000，μmol到nmol的转换系数。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 4.0007x + 0.0011，R2 = 0.9997；y，吸光度

按样本质量计算

单位定义：每g样本每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。

FCR（nmol/min/g 鲜重）=（△A-0.0011）÷4.0007×1000×V标÷(V样÷V样总×W)÷T

=8.331×（△A-0.0011）÷W

按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg蛋白每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。

FCR（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0011）÷4.0007×1000×V标÷(V样÷V样总×W)÷T

=8.331×（△A-0.0011）÷Cpr

V样总：加入提取液体积，1 mL；V样：反应中样品体积，50μL；V标：加入标准品体积 ，50μL；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；1000，μmol到nmol的转换系数。