正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。

测定原理：

ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×3瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂仍-20℃保存；

试剂四：粉剂×3瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：液体800μL×2支，4℃保存；临用前每支加入560μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂仍4℃保存；

试剂六：粉剂×3瓶，4℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用。用不完的试剂-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

试剂	测定管
试剂一（μL）	300
试剂二（μL）	250
试剂三（μL）	300
试剂四（μL）	300
试剂五（μL）	20
样本（μL）	50

试剂六（μL）

300

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min

将上述试剂按顺序加入1 mL玻璃比色皿中，加试剂六的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四、五和样本按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min以上，测定时加入1220µL混合液和300µL试剂六测定。

ICL活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2443×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=2443×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=4.886×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.52×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。