Strep-tag II 蛋白纯化试剂盒

 

货号：QYP1036

规格：1ml，5ml，10ml

保存条件：2-8℃保存，12个月（未开封），开封后最好6个月内用完

Strep-tag II为8个氨基酸的小标签，基本不影响融合蛋白的结构与功能。 本系统利用Strep-tag II与Strep-Tactin高亲和力相互作用，以及生物素变体与Strep-Tactin相互竞争替换作用的可逆反应，实现蛋白质的结合与分离纯化，且分离条件温和，温和的纯化参数能够保持蛋白质的生物活性。将Strep-Tactin蛋白共价偶联到琼脂糖微球表面，可实现高效，快速，温和纯化带有Strep-tag II标签的重组蛋白。

一.试剂盒组分

组分	规格	作用说明（以填料10ml为例）
Strep-Tactin亲和树脂​	10ml (50%悬液)	Strep-Tactin交联琼脂糖珠4FF，粒径45-165um，平衡载量约3-5mg/ml
平衡缓冲液​	100 mL*3瓶	模拟生理环境，用于洗涤和平衡树脂
洗脱缓冲液​	100 mL	含Desthiobiotin, 竞争性洗脱Strep-tag II标签蛋白
再生缓冲液	100 mL	洗脱Desthiobiotin，深度清洗琼脂糖微球
储存液​	100 mL	浸泡琼脂糖微球，维持活性，避免滋生细菌
重力流层析柱	1ml	10支1ml，或者其他规格可选，有3ml，6ml，12ml等

 

二. 操作流程（从细胞裂解液开始）

第1步：样品制备

采用适当方法裂解表达 Strep-tag II 重组蛋白的细胞,具体如下：

胞外表达蛋白可直接取培养上清，用等量的平衡缓冲液稀释。

动物细胞内表达蛋白，用适量PBS洗涤后收集细胞，再用适量含 1%（v/v） Triton X-100 或 1%（v/v）NP-40 的裂解液  重悬细胞。

大肠杆菌，酵母等胞内表达蛋白，用适量的平衡缓冲液稀释，再冰浴超声波裂解细胞。

以上环节都可酌情考虑加入蛋白酶抑制剂，如PMSF或者Cocktail类抑制剂。

将裂解液于 4°C， ≥12,000 × g 离心 10-20 分钟，以彻底去除细胞碎片和不可溶物质，上清液即为可上柱的蛋白溶液。建议保留少量上清用于后续SDS-PAGE分析。可根据需要，用平衡缓冲液适当稀释上清液，以降低样品粘度和离子强度，但非必需。

第2步：装柱与平衡（以1ml柱子为例，购买预装柱试剂盒不需要操作此步骤）

取一支空纯化柱，垂直固定于架子上。取下顶盖，让储存液自然流干。

树脂装填：​ 轻轻摇晃盛有Strep-Tactin®XT 树脂悬液的瓶子，使其充分混匀成均匀悬液。取1支空的层析柱，放入下层挡板，扣上出液口堵头，用移液器吸取1 mL 的50%树脂悬液（即实际树脂体积为0.5 mL），缓慢加入空纯化柱中，加上上层挡板，将琼脂糖珠轻轻压实。（如果想实现高结合率，也可不加上层挡板，让蛋白样本与琼脂糖珠充分的混匀结合，然后再进行后续步骤。）

平衡：​ 向柱缓慢持续中加入 5倍柱体积（约5ml）的纯水，再10倍柱体积的平衡缓冲液​进行平衡。液体在重力作用下，缓慢流下。（在整个平衡、上样、洗涤过程中，需确保液面始终高于树脂床表面，防止柱床干裂。）当平衡缓冲液液面降至与树脂床表面稍高1mm时，扣上下堵头，准备进行下一步上样操作。

第3步：上样

将准备好的澄清样品上清液加入层析柱，流速大约为0.3ml/min。如果样本量少，也可扣上层析柱上面的塞子，将整个柱子置于 4°C 冰箱温和旋转孵育 30-60 分钟，然后打开柱底部的出口，让样品在重力作用下缓慢流经树脂柱。收集少量流穿液，可用于SDS-PAGE分析，以评估结合效率。

第4步：洗涤

本步骤旨在去除非特异性吸附的杂蛋白。

待样品液面降至床面时，加入 10-15倍柱体积的平衡缓冲液（约10-15ml），让其自然流下，收集洗涤液。扣上下堵头，准备进行下一步上样操作。

第5步：洗脱与收集

准备一个干净的离心管管用于接收洗脱组分。加入 1ml的洗脱缓冲液到柱中，让其在柱中停留 1-2 分钟，使Desthiobiotin与Strep-tag II充分竞争平衡位点。打开出口，收集液体，即为第一洗脱峰，Elution 1，​通常含有最高浓度的目标蛋白。重复洗脱步骤2-3两次，分别收集为 Elution 2​ 和 Elution 3。也可以用5-10倍柱体积的洗脱液持续洗脱。洗脱完成后，用BCA蛋白定量或分光光度计测定各洗脱管的蛋白浓度，并通过SDS-PAGE分析纯度。

三、 树脂的再生、保存与注意事项

树脂再生（可重复使用3-5次）：

依次用以下溶液清洗使用过的树脂柱：

3 倍柱体积的平衡缓冲液，5倍柱体积的再生缓冲液，5倍柱体积的无菌水，最后加入20%乙醇水溶液浸泡柱床，并放置于4℃冰箱。

再生后的树脂可立即用于下一次纯化，也可以在冰箱中保存，有效期可达12个月。

注意事项：

1. 全程0-4°C​低温有助于抑制蛋白酶活性，防止蛋白降解。

2. 操作过程中要防止柱床干涸。

3.样品澄清，不澄清的样品会堵塞柱子，影响纯化效率和树脂寿命。

4.避免使用含游离生物素或高浓度还原剂（如DTT浓度 > 1 mM）的样品和缓冲液，它们会干扰平衡。如需还原环境，可使用TCEP。

5.洗脱液中的D-生物素可能干扰某些下游应用（如生物素化检测），可使用透析去除。透析后的蛋白样品，还可使用超滤离心管进行浓缩以提高浓度。

6.本试剂盒仅用于科研，不做其他用途。