注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

铜蓝蛋白是血浆的含铜蛋白，有运输铜的功能，同时具有氧化酶的活性，是细胞外液重要的抗氧化剂。

测定原理:

铜蓝蛋白催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺生成蓝色产物，在645nm处有特征吸收峰，依此可得铜蓝蛋白活性。

自备实验用品及仪器:

天平、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体7mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。（使用前37℃预热）

样本前处理：

血清（浆）等液体样本：直接检测。

动植物组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL蒸馏水，进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定操作表:

分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至645nm，蒸馏水调零。

操作表

计算公式:

	空白管	测定管
样品（µL）	30	30
试剂一（µL）	90	90
试剂二（µL）	60
混匀，37℃预热5min
试剂三（µL）	120	120
混匀，37℃反应30min
试剂二（µL）		60
混匀，25℃室温放置5min，取200µL于微量石英比色皿/96孔板中，测定645nm处吸光值。 ΔA=A测定-A空白。

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

按体积计算

酶活定义:37℃条件下， 每分钟每毫升样品与底物作用吸光度升高0.01为一个酶活单位。

Cp活力（U/mL）=ΔA×V反总÷0.01÷V样÷T = 33.33×ΔA

按鲜重计算

单位定义：37℃条件下，每分钟每克样品与底物作用吸光值升高0.01为一个酶活单位。

Cp活力（U/g鲜重）=ΔA×V反总÷0.01÷（W×V样÷V样总）÷T = 33.33×ΔA÷W

按蛋白浓度计算

单位定义：37℃条件下，每分钟每毫克蛋白样品与底物作用吸光值升高0.01为一个酶活单位。

Cp活力（U/ mg prot）=ΔA×V反总÷0.01÷（Cpr×V样）÷T = 33.33×ΔA÷Cpr

V样：0.03 mL；V反总：0.3 mL；T：反应时间，30min；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

按体积计算

酶活定义:37℃条件下， 每分钟每毫升样品与底物作用吸光度升高0.005为一个酶活单位。

Cp活力（U/mL）=ΔA×V反总÷0.005÷V样÷T = 66.66×ΔA

按鲜重计算

单位定义：37℃条件下，每分钟每克样品与底物作用吸光值升高0.005为一个酶活单位。

Cp活力（U/g鲜重）=ΔA×V反总÷0.005÷（W×V样÷V样总）÷T = 66.66×ΔA÷W

按蛋白浓度计算

单位定义：37℃条件下，每分钟每毫克蛋白样品与底物作用吸光值升高0.005为一个酶活单位。

Cp活力（U/ mg prot）=ΔA×V反总÷0.005÷（Cpr×V样）÷T = 66.66×ΔA÷Cpr

V样：0.03 mL；V反总：0.3 mL；T：反应时间，30min；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项:

试剂二和试剂三有一定的毒性和刺激性，请操作时做好防护措施。