正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。

测定原理：

蛋白质中的赖氨酸具有一个游离的ε-NH2，它与茚三酮试剂反应生成蓝紫色物质，其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸的含量成线性关系。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，而且仅有—个游离氨基(ε-NH2)，所以通常用亮氨酸配制标准液。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水、水浴锅。

试剂的组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入12.5mL试剂三充分溶解混匀；

试剂二：液体12.5mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存；

试剂四：60%乙醇，自备。

赖氨酸提取：

样本烘干粉碎，称取约0.01g样本，加入1mL提取液，充分匀浆。80℃水浴提取20min，冷却后10000g离心10min，取上清待测。

测定步骤

分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

工作液的配制：取10mL试剂一与10mL试剂二混合摇匀，取上清备用。用不完的试剂4℃保存。

在有盖EP管中加入下列试剂：

混匀，80℃水浴30min（盖紧，以防止水分散失），冷却至常温。

混匀，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，于530nm波长处记录吸光值A。△A=A测定管-A空白管。空白管只要做一管。

试剂名称（μL）	测定管	空白管
样本	100
提取液		100
工作液	200	200

试剂四

300

300

赖氨酸含量计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为y = 0.0062x - 0.0212；x为赖氨酸含量（µg/mL），y为吸光值。

1.按照蛋白浓度计算

赖氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515

=185.73×(△A+0.0212) ÷Cpr

2.按照样本质量计算

赖氨酸含量(µg/g干重)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515

=185.73×(△A+0.0212) ÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1.1515，校正系数。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为y = 0.0031x - 0.0212；x为赖氨酸含量（µg/mL），y为吸光值。

1.按照蛋白浓度计算

赖氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0031×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515

=371.45×(△A+0.0212) ÷Cpr

2.按照样本质量计算

赖氨酸含量(µg/g干重)= [(△A +0.0212)÷0.0031×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515

=371.45×(△A+0.0212) ÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1.1515，校正系数。