正式测定前取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

花色苷是一类易溶于极性溶剂的天然色素，属黄酮类化合物。花色苷广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中，使其呈现由红到紫等不同颜色，是植物主要的呈色物质。

测定原理：

采用pH示差法测定花色苷含量，当pH为1.0时花色苷在530nm处有最大吸收峰,而当pH为4.5时,花色苷转变为无色查尔酮形式,在530处无吸收峰, 利用此特性分别测定在不同pH下的530nm和700nm处的吸光度值。pH示差法减少了溶液pH和溶剂差异的影响，排除了其他非花色苷类物质对检测结果的干扰。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体100 mL× 1瓶，4℃保存；

试剂一：液体20 mL× 1瓶，4℃保存；

试剂二：液体20 mL × 1瓶，4℃保存；

花色苷的提取：

按照烘干样品质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g烘干样品，加入1mL提取液），充分匀浆后转移到EP管中，提取液定容至1 mL，盖紧后4℃浸提24 h，8000 g，常温离心10 min，取上清液待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上；试剂一和试剂二25℃（室温）预热10min以上；

2、取20 µL上清液和180 µL试剂一（相当于稀释10倍），40℃水浴20min，分别测定530nm和700nm处的吸光值，分别记为A1和A2。

取20 µL上清液和180 µL试剂二（相当于稀释10倍），40℃水浴20min，分别测定530nm和700nm处的吸光值，分别记为A3和A4。

计算△A=(A1-A2)-(A3-A4)

注意：如果A1大于1，可以适当加大稀释倍数，保证总体积200 µL不变，如10 µL上清液和190 µL试剂一（相当于稀释20倍）；如果A1小于0.1，可以适当缩小稀释倍数，保证总体积不变，如100 µL上清液和100 µL试剂一（相当于稀释2倍），使A1保持在0.1~1范围内，可提高检测灵敏度；同样调整上清液和试剂二体积比例；计算时以实际稀释倍数代入下述公式中。

花色苷含量计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

花色苷含量（µg/g干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×106]÷W=16.7×ΔA× F÷W

V：提取液体积，1×10-3L；ε：花色苷的摩尔消光系数，2.69×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；M：花色苷的相对分子质量：449.2g/mol；F：稀释倍数；106：1g=106µg；W：样本干重：g。

b.用96孔板测定的计算公式如下

花色苷含量（µg/g干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×106]÷W=33.4×ΔA× F÷W

V：提取液体积，1×10-3L；ε：花色苷的摩尔消光系数，2.69×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；M：花色苷的相对分子质量：449.2g/mol；F：稀释倍数；106：1g=106µg；W：样本干重：g。

ΔA线性范围为0.005-0.5。