注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素P450和细胞色素b5是P450酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与P450代谢活性密切相关。

测定原理：

氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后，在424nm处有最大吸收峰，通过测定424nm和490nm处吸光值的差异，即可计算出细胞色素b5的含量。

自备仪器和用品：

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×2瓶，4℃保存。临用前各加100mL蒸馏水，充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。

工作液配制：临用前配制，戴一次性手套，小心打开试剂三瓶盖，加试剂二20mL充分溶解，4℃避光可保存1周。

样品中细胞色素b5提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体：100 000g，4℃离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、待测液：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，该待测液需当天测定。

细胞色素b5含量测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min。

2. 工作液置于25℃水浴中预热30 min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入10 μL蒸馏水，200μL工作液，室温静置2 min，424nm和490nm处吸光值，424nm处吸光值记为A空白管1，490nm处吸光值记为A空白管2。△A空白管= A空白管1- A空白管2

4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入10 μL待测液，200μL工作液，室温静置2 min，424nm和490nm处吸光值，424nm处吸光值记为A测定管1，490nm处吸光值记为A测定管2。

△A测定管= A测定管1- A测定管2。

注意：只需要做一个空白管。

样品细胞色素b5含量计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

细胞色素b5含量(nmol/mg prot) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷（Cpr×V样）

= 122.8×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按样本质量计算

细胞色素b5含量（nmol/g 鲜重）= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×（V样总÷V样）÷W

= 61.4×(△A测定管-△A空白管)÷W

ε：还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数，171×10-6 L/nmol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm； V反总：反应体系总体积，210 μL =2.1×10-4 L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V样：加入反应体系中待测液体积，10 μL=0.01 mL；V样总：待测液总体积，0.5 mL；W：样品质量（g）。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

细胞色素b5含量(nmol/mg prot) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷（Cpr×V样）

= 245.6×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按样本质量计算

细胞色素b5含量（nmol/g 鲜重）= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×（V样总÷V样）÷W

= 122.8×(△A测定管-△A空白管)÷W

ε：还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数，171×10-6 L/nmol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5cm； V反总：反应体系总体积，210 μL =2.1×10-4 L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V样：加入反应体系中待测液体积，10 μL=0.01 mL；V样总：待测液总体积，0.5 mL；W：样品质量（g）。