正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

土壤蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化，其水解产物是高等植物的氮源之一。S-NPT在中性环境下催化蛋白质水解，与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。

测定原理：

中性条件下，S-NPT可将酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。

实验中所需仪器及设备：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板、双蒸水

试剂组成和配置：

试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5ml蒸馏水充分溶解；用不完的试剂4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入50μL试剂七使粉剂润湿，然后加入10ml试剂一，转入烧杯中沸水浴磁力搅拌溶解后待用；用不完的试剂4℃保存；（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热15-30分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入20ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存；

试剂五：液体3mL×1瓶，4℃保存；

试剂六：液体1.5mL×1支，50μg/ml标准酪氨酸溶液，4℃保存；

试剂七：液体1.5mL×1支，4℃保存；

样品处理：

胞外酶：取1mL样本，8000g 25℃离心10min，取上清液测定。

胞内酶: 取1mL样本，8000g 25℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入1mL蒸馏水，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），8000g 25℃离心10min，取上清液测定。

测定操作：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。

2、试剂二、三和四40℃水浴10min。

3、样本测定：

试剂名称	测定管	对照管
样本（μL）	10	10
试剂一（μL）	50	150
试剂三（μL）	100

试剂二（μL）

50

50

	测定管	对照管	标准管
上清液（μL）	30	30
试剂六（μL）			30
试剂四（μL）	140	140	140
试剂五（μL）	30	30	30

混匀后，40℃水浴30min，振荡5-6次，使土样与反应液充分接触

混匀，8000g 25℃离心10min，取上清液，在EP管或96孔板中加入下列试剂

混匀，40℃水浴20min，680nm下读取各管吸光值A

注意：标准管只需测一次。每个测定管设一个对照管。

S-NPT活性计算：

按样本体积计算

单位定义：每min每mL样本产生1μg酪氨酸为一个 S-NPT活力单位。

S-NPT(μg/min/mL)=C标准×(A测定管-A对照管)÷A标准管×V反总÷V样÷T=35×(A测定管-A对照管)÷A标准管

按样本蛋白浓度计算

单位定义：每min每mg组织蛋白产生1μg酪氨酸为一个 S-NPT活力单位。

S-NPT(μg/min/mg prot)=C标准×(A测定管-A对照管)÷A标准管×V反总÷V样÷T÷Cpr =35×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷Cpr

C标准管：标准管浓度， 50μg/mL；V反总：反应体系总体积，0.21mL；T：反应时间，30min； V样：样本体积，0.01mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。