注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

亚硝酸盐广泛存在于水体和土壤中，不仅是有机氮分解的重要中间产物，也可能来自污染。人体摄入过量后，可诱发消化系统癌变。

测定原理：

在酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应生成重氮化合物，再与N-1-萘基乙二胺形成紫红色偶氮化合物，在540nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、常温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，室温保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

样品处理：

土壤样品：准确称取过筛后的土壤约0.2g，加入1 mL 提取液，室温震荡1h，8000g，25℃离心15min，静置，待其分层后，取上清液待测。

水样：直接检测；如果浑浊，可以离心后再测定。

测定步骤和操作表：

分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

操作表

	测定管	空白管
提取液（µL）		70
样品（µL）	70
试剂一（µL）	65	65
试剂二（µL）	65	65
混匀，25℃静置15min，于微量石英比色皿/96孔板中检测540nm处吸光值A。 △A=A测定 - A空白

注意：空白管只需测定一次。

亚硝酸盐含量计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y=0.234x + 0.0002，R2= 0. 999 x为标准品亚硝酸钠浓度（μg/ml） y为吸光值A。

NO2-（μg/g）=（△A-0.0002）÷0.234×V样÷（V样÷V样总×W）×0.6668

=（A – 0.086）÷0.234×1.5×0.6668÷W

=4.27×（△A-0.0002）÷W

V样总：加入提取液体积，1.5 mL； V样：反应中样品体积，0.07mL；W：样品质量，g。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y=0.141x +0.095，R2= 0. 9991 x为标准品亚硝酸钠浓度（μg/ml） y为吸光值A。

NO2-（μg/g ）=（△A-0.0002）÷0.141×V样÷（V样÷V样总×W）×0.6668

=（△A-0.0002）÷0.141×1.5×0.6668÷W

=7.09×（△A-0.0002）÷W

V样总：加入提取液体积，1.5 mL； V样：反应中样品体积，0.07mL；W：样品质量，g。

注意事项：

试剂盒2-8℃保存。

试剂对人体有一定的危害，请穿实验服，戴手套操作。

若检测出得OD值在标准曲线范围外，请将样品进行适当的浓缩或稀释（A540 <0.09浓缩，A540 > 1.5 适当稀释）。

最低检出限为0.5μg/g。