注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

磷的存在形态包括无机磷与有机磷。无机磷主要指磷酸根，参与生物体内多种代谢，包括能量代谢、核酸代谢、蛋白质磷酸化和脱磷酸化等。通过测定总磷与无机磷含量即可了解作物对磷的利用率，进而为合理施肥提供依据。

测定原理：

植株样品用硫酸-过氧化氢消化，使各种形态磷转变成正磷酸盐，正磷酸盐与钼锑抗显色剂反应，生产磷钼蓝，蓝色溶液的吸光度与含磷量呈正比例关系，用酶标仪测定。

自备仪器和用品：

石墨消解仪、离心机、水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水和浓硫酸。

试剂组成和配置：

试剂一：液体 50ml

试剂二：液体 5ml

试剂三：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加0.2mL蒸馏水溶解。

试剂四：液体0.4mL×1支，4℃保存。

工作液：临用前将试剂三和试剂四混合，加19.4mL蒸馏水混匀。(提供20mL棕色空瓶)

样本消化：

将植物样本80℃烘干至恒重后粉碎，过40目筛，称取约0.3g，加入消化管中，同时取空消化管两支，用移液管分别往每管中加入10mL浓硫酸，轻轻晃动消化管。

将20支消化管全部置于石墨消解仪上，盖好盖子，打开废气回收系统以及石墨消解仪，温度设置为：曲线加热100℃，10min；280℃，10min；400℃，40min。

将消化管冷却至室温，切勿在样品冷却之前开盖。每支消化管中缓慢加入1mL试剂二，摇匀，重新放置在石墨消解仪上，温度设置为：曲线加热200℃，10min；320℃，10min；400℃，30min。

取出消化管冷却至室温，切勿在样品冷却之前开盖。每支消化管中缓慢加入0.5mL试剂二，摇匀，重新放置在石墨消解仪上，温度设置为：曲线加热200℃，10min；320℃，10min；400℃，30min。若样本未呈现澄清状态，应重复步骤4至澄清，即消解完全。

关闭石墨消解仪，待样品冷却后关掉废气回收系统。

取2mLEP管，每个加900uL蒸馏水，再加100uL消解液混匀后，再加试剂一500uL，混匀后待测。

测定操作表

	空白管	测定管
样本（μL）		20
提取液（μL）	20
工作液（μL）	180	180
充分混匀，25℃静置30min
于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定700nm处吸光值A，分别记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管

注意：空白管只需测定一次。

计算公式

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 2.1476x -0.0011，R2 = 0.9983(x为标准磷浓度，μmol/mL；y为吸光值A)

全磷含量（g/kg）=（△A+0.0011）÷ 2.1476×V总÷W×10-3×31

= 1.443×（△A+0.0011）÷W

V总：加入提取液体积，100mL，W：样本质量，g

用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 1.0738x -0.0011，R2 = 0.9983；(x为标准磷浓度，μmol/mL；y为吸光值A)

全磷含量（g/kg）=（△A+0.0011）÷ 1.0738×V总÷W×10-3×31

= 2.887×（△A+0.0011）÷W

注意事项

配好的试剂3天内使用完。

最低检出限为11mg/Kg。