正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

山梨醇广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，不仅是糖运输形式之一，而且与生物抗逆性和食物风味密切相关。因此，在糖代谢、抗逆性和食品研究中经常需要检测山梨醇含量变化。

测定原理：

山梨醇在碱性溶液中与铜离子形成蓝色络合物，在655nm波长有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体3.5mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体3.5mL×1瓶 ，4℃保存。

山梨醇的提取：

按照组织质量（g）：蒸馏水体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL蒸馏水），研磨成匀浆，95℃水浴10分钟（盖紧，以防止水分散失），冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清液待测。

测定步骤

分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至655nm，蒸馏水调零。

2、加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：

试剂（μL）	空白管	测定管
试剂一	35	35
试剂二	35	35
样本		230
蒸馏水	230

混匀后室温静置15min，8000g，25℃离心10min，取200μL上清液至微量石英比色皿或96孔板中，测655nm下吸光值A，计算ΔA=A测定管-A空白管。空白管只要做一管。

山梨醇含量计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.352x - 0.002；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、按照样品质量计算

山梨醇含量（mg /g 鲜重）＝[(ΔA＋0.002) ÷0.352×V1]÷(W×V1÷V2)=2.84×(ΔA＋0.002) ÷W

3、按照样本蛋白浓度计算

山梨醇含量（mg /mg prot）＝[(ΔA＋0.002) ÷0.352×V1]÷(V1×Cpr)=2.84×(ΔA＋0.002) ÷Cpr

V1：加入样本体积，0.23mL；V2：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.176x - 0.002；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、按照样品质量计算

山梨醇含量（mg /g 鲜重）＝[(ΔA＋0.002) ÷0.176×V1]÷(W×V1÷V2)=5.68×(ΔA＋0.002) ÷W

3、按照样本蛋白浓度计算

山梨醇含量（mg /mg prot）＝[(ΔA＋0.002) ÷0.176×V1]÷(V1×Cpr)=5.68×(ΔA＋0.002) ÷Cpr

V1：加入样本体积，0.23mL；V2：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意：最低检测限为1μg/g鲜重或0.01μg /mg prot