注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

磷是植物必需大量元素。植物主要通过根系从土壤中获取磷元素。土壤磷包括有机磷和无机磷。土壤有机磷经过矿化分解而转化为无机磷，才能进一步被植物吸收利用。

测定原理：

从土壤中提取无机磷，在酸性环境中，通过钼蓝法定磷，即可计算出无机磷含量。

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、可调式水浴锅，分析天平、可调式移液器、蒸馏水和100目筛子。

试剂组成和配制：

提取液：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前配制，加入8mL蒸馏水，充分溶解后加入4mL试剂二，混匀。

标准品：液体×1支，20μmol/L无机磷标准液，4℃保存。

土壤无机磷提取：

取10mL离心管，加入精确称取的100目筛子过筛的风干土样约0.01g，加入1mL提取液，震荡混匀，然后置于40℃水浴浸提1h，8000g，25℃，离心10min，取上清液，待测。

测定步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。

2. 打开水浴锅，调节温度到40℃。

3. 空白管：取EP管，依次加入100μL蒸馏水，100μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度，记为A空白管。

4. 标准管：取EP管，依次加入10μL标准液，90μL蒸馏水，100μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 测定管：取EP管，依次加入10μL上清液，90μL蒸馏水，100μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度，记为A测定管。

需在40min内完成比色。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

土壤无机磷含量计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

S-PHOS（μmol /g 干重）=[C标准液×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)]×V总÷W

=0.02×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)÷W

C标准液：20 μmol/L；V总：总上清液体积，1 mL=0.001 L；W：土壤样品质量，g。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

S-PHOS（μmol /g干重）=[C标准液×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)]×V总÷W

=0.02×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)÷W

C标准液：20 μmol/L；V总：总上清液体积，1 mL=0.001 L；W：土壤样品质量，g。

注意事项：

试剂三需临用前配制，限当天使用。试剂三配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。

40min内完成比色。