注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用中的关键酶之一，参与亚硝酸盐至NO的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。

测定原理

亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2—减少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。

试剂的组成和配制

试剂一：液体4mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。

试剂三：液体4mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）

试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）

试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。

样品处理

新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。

测定操作表

	空白管	对照管	测定管
风干土样（g）		0.02	0.02
蒸馏水（μL）		40
试剂一（μL）	40		40
试剂二（μL）	40	40	40
混匀后，25℃反应1h
试剂三（μL）	40	40	40
充分震荡30S，10000rpm，4℃，离心10min
上清液（μL）	70	70	70
工作液（μL）	140	140	140
充分混匀，静置3min后测定540nm处吸光值，分别记为A空白管、A对照管、A测定管。空白管只要做一管，每个测定管需设一个对照管。

计算公式

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 1.5562x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。

酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO2ˉ 的量为一个酶活力单位。

S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷1.5562×V标÷W÷T

= 0.617×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W

T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04mL；W：样本质量，g。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.7781x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。

酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO2ˉ 的量为一个酶活力单位。

S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷0.7781×V标÷W÷T

= 1.234×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W

T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04mL； W：样本质量，g。

注意事项

配制好的工作液3天内使用完。

若吸光值超过1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。

严格控制显色时间，否则会对结果有影响。

标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-1.5。