正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
叶绿体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理：
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂三：8mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入4mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂六：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂七：液体10mL×1 瓶，室温保存。
定磷试剂的配制：按H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
叶绿体的提取：
称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆，很快研磨或捣碎，30秒内完成，使之成为匀浆液。
将匀浆液于200g（离心率），4℃离心1min。
弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，1500g，4℃离心5min。
弃上清液，于沉淀中加入0.5mL试剂一混匀配成叶绿体悬浮液。混匀后测定叶绿体酶活性。
测定步骤：
1、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）
试剂名称（μL）
对照管
测定管
试剂二
10
10
试剂三
40
40
样本
50
试剂四
20
20
样本
50
混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min
上清液
30
30
定磷试剂
170
170
混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液
2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂）
混匀，室温静置10min后，在 660nm处读取A测定管和A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。
复合体Ⅴ活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T
=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =31.37× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.063× (ΔA-0.004)
V反总：反应体系总体积，1.2×10-4 L； V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，0.5 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 0.637x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T
=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T
=62.74× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T
=0.126× (ΔA-0.004)
V反总：反应体系总体积，1.2×10-4 L； V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，0.5 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
