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半胱氨酰亚砜裂解酶(L-cysteinesulfoxidelyase,CSL)--微量法
半胱氨酰亚砜裂解酶(L-cysteinesulfoxidelyase,CSL)--微量法
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半胱氨酰亚砜裂解酶(L-cysteinesulfoxidelyase,CSL)--微量法
市场价格
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实验室客户: ¥1170.0
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商品描述

商品属性

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

半胱氨酰亚砜裂解酶(CSL)广泛存在于百合科葱属(如大蒜和洋葱),十字花科芸薹属

(如卷心菜,菜花,西兰花),以及豆科中的合金欢属中,并通常被称为蒜氨酸酶(Alliinase)。香菇酸在γ-谷氨酰转肽酶和半胱氨酸亚砜裂解酶的作用下转化成香菇精,以及产生丙酮酸、乙醛、甲醛和NH3。CSL是内源性甲醛生成的关键酶之一,测定CSL活性对于研究食品安全具有重要意义。

测定原理

CSL催化S-甲基-L-半胱氨酸亚砜反应产生丙酮酸,与2,4-二硝基苯肼反应,在碱性条件下显棕红色,在510nm下有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、酶标仪、96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂×1瓶,4℃避光保存,临用前加入2mL水溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存,临用前加入10mL水溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存;

试剂三:液体15mL×1瓶,4℃保存。

试剂四:液体6mL×1瓶,4℃避光保存。

试剂五:液体30mL×1瓶,4℃保存。

样本处理

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆,4℃浸提40min。12000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定操作

 

对照管

测定管

样品(μL)

50

50

试剂一(μL)

 

25

蒸馏水(μL)

25

 

试剂二(μL)

25

25

充分混匀,37℃反应20min

试剂三(μL)

100

100

试剂四(μL)

50

50

充分混匀,室温反应5min

试剂五(μL)

250

250

充分混匀,静置5min,吸取200μL至96孔板,测定510nm处吸光值,记为A对照和A测定,△A=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。

计算公式

标准曲线:y = 0.7313x + 0.0027,R2 = 0.9993;x为标准品浓度:μmol/mL;y为吸光度△A

按蛋白含量计算

C-S lyase活性(μmol/min/mg prot)=(△A -0.0027)÷ 0.7313×V样÷(V样×Cpr )÷T

=0.068×(△A-0.0027)÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

C-S lyase活性(μmol/min/g 鲜重)=(△A -0.0027)÷ 0.7313×V样÷(V样÷V样总×W )÷T

=0.068×(△A-0.0027)÷ W

V样,加入样本上清体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T,反应时间,20min。

注意事项

若测定结果中吸光值超过1,请将样本稀释后进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。香菇类样本活性较大,可能需要稀释80-100倍。

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