正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

Hephaestin (HP)作为铜蓝蛋白的同系物,是近年来发现的铁转运蛋白亚铁氧化酶，HP属亚铁氧化酶家族成员,具有亚铁氧化酶的活性,参与体内铁代谢。HP的表达可受铁、铜及锌等金属离子的调节。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+，在介导铁的跨膜转运中有重要作用。

测定原理：

HP催化Fe2+氧化为Fe3+，Fe2+和ferrozine反应显色，在560 nm下有特征吸光值。通过测定Fe2+的减少速率可测得亚铁氧化酶的活性。

自备用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体60 mL×1瓶，4℃保存;

试剂二：液体1.5 mL×1瓶，4℃保存;

试剂三：液体11 mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：水（mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL蒸馏水），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

酶标仪预热30 min以上，调节波长至560 nm。

2. 在96孔板中加入下列试剂

试剂名称（μL）	测定管	对照管
试剂一	50	50
试剂二	10	10
样本	10	10
蒸馏水	30	30
试剂三	混匀，40℃静置30 min	100
试剂三	100
混匀，立即测定A对照和A测定，ΔA=A对照-A测定。(每个测定管需设一个对照管)

HP活性计算:

标准曲线：y = 8.2135x - 0.0006，R2 = 0.9998；(x为标准品浓度，μmol/mL；y为吸光值ΔA)

按样本质量计算

单位定义：每g样本每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位。

HP（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V总÷T ÷(W× V样÷V样总)× 1000

= 40.58×（△A+0.0006）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg蛋白每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位。

HP（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V总÷T ÷（Cpr×V样）

= 40.58×（△A+0.0006）÷Cpr

V总：反应体系体积，0.1 mL；V样：加入样本体积0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；1000，μmol到nmol的转换系数。