正式测定管前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

蔗糖不仅是重要的光合产物，也是植物体内运输的主要物质，还是碳水化合物的贮存形式之一。SPS（EC 2.4.1.14）以果糖-6-磷酸为受体，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径。

测定原理

蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。

需自备的的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰

试剂的组成和配制

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体2mL×1瓶，4℃保存

试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：液体6mL×1瓶，4℃避光保存；

样品测定的准备：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零。

样本测定，（在EP管中依次加入下列试剂）：

试剂名称（μL）	测定管	对照管	标准管	空白管
样本	10	10
蒸馏水		45	45	55
试剂二			10
试剂一	45

试剂三

15

15

15

15

试剂四	210	210	210	210
试剂五	60	60	60	60

混匀，25℃准确水浴10min

沸水浴中煮沸10min左右（盖紧，以防止水分散失），冷却

混匀，沸水浴30min，冷却后，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下测定各管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。

SPS活力单位的计算

1、按照蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。

SPS活性(μg /min/mg prot)= C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷Cpr

2、按照样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。

SPS活性(μg /min/g鲜重) = C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷W

C标准管：标准管浓度，1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL； V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；T ：反应时间：10min。