注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通过质膜上的细胞色素b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。

测定原理：

AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。

实验中所需仪器及设备：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2mL蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

AAO测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到265 nm。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL预热的试剂二和10μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。

AAO活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T

= 92.4×△A÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T

= 92.4×△A÷W

ε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm； V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；

T：催化反应时间（min），2min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T

=184.8×△A÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T

= 184.8×△A÷W

ε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5 cm； V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；

T：催化反应时间（min），2min。

注意事项:

配制好的试剂放在4℃保存，三天内使用完。