注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

测定原理

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，根据ΔA值可以计算样品中O2－含量，反应式为NH2OH + 2O2－ ＋H＋ → NO2－ ＋ H2O2 ＋ H2O。

自备实验用品及仪器

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、氯仿和蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体20mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：氯仿，自备。

超氧阴离子提取

植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。。

细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

血清或培养液：直接测定。

测定操作表

	空白管	测定管
样本（μL）		500
提取液（μL）	500
试剂一（μL）	400	400
混匀，37℃水浴20min
试剂二（μL）	300	300
试剂三（μL）	300	300
混匀，37℃水浴20min
试剂四（μL）	500	500
混匀，8000g，25℃，离心5min，小心吸取上层水相1mL， 1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定A530。ΔA=A测定-A空白，空白管只要做一管。

超氧阴离子含量计算公式

标准曲线：y = 0.0242x - 0.0027，R2=0.9980

1. 组织：

（1）按照样本质量计算

超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (ΔA +0.0027)÷0.0242×V反总÷(V样÷V样总×W)×2

=148.76×(ΔA +0.0027)÷W

超氧阴离子产生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

=7.44× (ΔA +0.0027)÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反总÷(V样×Cpr)×2

=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（nmol/104 cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)×2

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（nmol/104 cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子 含量（nmol/mL）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反总÷V样×2

=148.76× (ΔA+0.0027)

超氧阴离子产生速率（nmol/mL·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44× (ΔA+0.0027)

V样总：加入提取液体积，1 mL； V反总：反应总体积，0.9mL；V样：反应中样品体积，0.5mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2： 2分子O2－参与反应生成1分子NO2－。

注意事项

吸光值大于2，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

样品制备好之后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。

试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。