正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，大量存在于高等动物的肝脏和弱氧化醋杆菌中。在低聚果糖生产中使用GCDH，不仅能去除低聚果糖中的葡萄糖提高低聚果糖的含量，而且生成的葡萄糖酸与钙离子结合生成的葡萄糖酸钙是一种理

想的补钙制剂。因而，GCDH已成为制备高含量低聚果糖的理想用酶。

测定原理：

GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH，在340nm下测定NADH上升速率，即可反映GCDH活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体47.5 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；

样本的前处理：

组织的前处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

细菌或培养细胞的前处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；

工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

将工作液置于37℃预热5分钟。

在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL工作液，立即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

GCDH活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=6.43×ΔA

V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。