注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。

测定原理

样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。

自备实验用品及仪器

天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、无水乙醇、异丙醇、6mol/L盐酸和蒸馏水。

试剂组成和配制

组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。

细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

羟脯氨酸提取

组织：称取约0.5g样品于玻璃管，加入5mL的组织提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小时，用提取液定容至5mL，12000g，25℃，离心20min，取上清待测。

细胞：取500万个细胞，加入2mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然降压后待测。

血清游离羟脯氨酸提取：取0.2mL血清，加入1mL无水乙醇使蛋白质沉淀，8000g4℃离心5min。将上清倒入另一个EP管，氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。冷却后再加入0.4mL50%异丙醇，充分溶解混匀待测。

测定操作表

	空白管	测定管
样本（µL）		200
试剂一（µL）	200	200
混匀，室温静置20min
试剂二（µL）	200	200
H2O（µL）	600	400
混匀，60℃，20min，取出后25℃静置15 min，蒸馏水调零，1mL玻璃比色皿中检测560nm处吸光值。ΔA=A测定-A对照

羟脯氨酸含量计算公式

标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991

（1）按组织计算

HYP含量（mg/g 鲜重）=（ΔA -0.0251）÷ 64.875×V反总÷(V样÷V样总×W)

= 0.385×（ΔA -0.0251）÷W

（2）按细胞计算

HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA -0.0251）÷ 64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个)

= 0.154×（ΔA -0.0251）÷细胞数量（万个）

（3）按液体体积计算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA -0.0251）÷ 64.875×V反总÷V样×2

= 0.154×（ΔA -0.0251）

V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样品体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积， mL； W：样品质量，g；2，血清吹干后复溶的倍数。

注意事项

OD值大于0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。

最低检出限为3.8mg/L。