注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。

测定原理

木质素过氧化物酶催化天青脱甲基，在651nm处测定吸光值减少。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、低温离心机、分光光度计、1 mL玻璃比色皿、可调式移液器、冰。

试剂组成和配制

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入80mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存1个月。

试剂二：液体12mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体12mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取

组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

培养液或其它液体：直接检测。

测定操作

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至651nm，蒸馏水调零。

2、临用前按每个样本试剂一：试剂二：试剂三= 400:200:200（μL）的比例配制工作液，现配现用。

3、在1mL玻璃比色皿中依次加入如下试剂

	测定管
样品（μL）	200
工作液（μL）	800
充分混匀，立即测定651nm处10s和130s吸光值，记为A1和A2，△A=A1- A2

酶活计算公式

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A651变化0.02为一个酶活力单位。

LiP活性（U/mg prot）= ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.02÷T =125×ΔA÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A651变化0.02为一个酶活力单位。

LiP活性（U/g 鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.02÷T =125×ΔA÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A651变化0.02为一个酶活力单位。

LiP活性（U/104 cell）＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.02÷T =0.25×ΔA

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A651变化0.02为一个酶活力单位。

LiP活性（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.02÷T =125×ΔA

V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样本体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min