正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

SH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。

测定原理：

SH催化山梨醇脱氢生成果糖，同时还原NAD+生成NADH，测定340nm吸光度增加速率可以计算SH活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前每瓶加入15mL蒸馏水，用不完的试剂仍4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入15mL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

样本测定

试剂名称(μL)	测定管
试剂一	400
试剂二	300
试剂三	300

样本

50

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴5min

将上述试剂按顺序加入1 mL玻璃比色皿中，加样本的同时开始计时，记录 20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

SH活性计算：

1、血清（浆）SH活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/mL）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1688×ΔA

2、组织、细菌或细胞中SH活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1688×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=1688×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=3.376×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.05×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。