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外切-β-1,4-葡聚糖酶(C1)/纤维二糖苷酶活性测定试剂盒--分光光度法
外切-β-1,4-葡聚糖酶(C1)/纤维二糖苷酶活性测定试剂盒--分光光度法
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外切-β-1,4-葡聚糖酶(C1)/纤维二糖苷酶活性测定试剂盒--分光光度法
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商品描述

商品属性

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

C1(EC3.2.1.91)存在于细菌、真菌和动物体内,是纤维素酶系的组份之一,C1催化多聚糖链的末端非还原端释放出纤维二糖和葡萄糖。

测定原理:

采用3,5-二硝基水杨酸法测定C1催化微晶纤维素降解产生的还原糖的含量。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体15mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:液体60mL×1瓶,4℃保存;

样品测定的准备:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。

2、加样表(在EP管中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL)

测定管

对照管

样本

50

50

试剂一

500

 

蒸馏水

 

500

试剂二

1000

1000

混匀,37℃准确水浴2h

混匀, 90℃水浴10min(盖紧,防止水分散失),冷却后,测540nm下吸光值A,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

C1活性计算

1、标准条件下测定回归方程为y = 6.4078x - 0.0673;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。

2、血清(浆)C1活力的计算

单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷V样÷T

=14.305×(ΔA+0.0673)

3、细胞、细菌和组织中C1活力的计算

(1)按照蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

C1活力(μg /min /g鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

C1活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T

=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000:1mg/mL=1000ug/mL;V反总:反应体系总体积,0.55mL; V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,120 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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