正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

测定原理

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体55.5mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，4℃保存；

试剂六：粉剂×1支，4℃保存；

试剂七：粉剂×1支，4℃保存;

试剂八：粉剂×1支，4℃保存;

试剂九：粉剂×1支，-20℃保存;

试剂十：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2.1mL蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

将匀浆600g，4℃离心5min。

弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH（此步可选做）。

在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体α-KGDH活性测定。

测定步骤

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm处，蒸馏水调零。

2、工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

3、在1mL石英比色皿中依次加入40μL试剂十、60μL样本和1.1mL工作液，混匀，立即记录340nm处20s的吸光值A1和2min20s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

α-KGDH活性计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.65×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.2×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.06 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。