注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

H2S是一种新型气态信号分子，存在于脑内的神经递质，生理浓度的H2S对神经系统海马的长时程增强功能具有重要的调节作用，并对自发性高血压、出血性休克及肝硬化等疾病的过程发挥着重要的病理生理效应。

测定原理

H2S与醋酸锌、N, N-二甲基对苯二胺和硫酸铁铵等反应生成亚甲基蓝，亚甲基蓝在665nm处有最大吸收峰，通过测定其吸光值可计算H2S含量。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体32mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体16mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体16mL×1瓶，4℃保存。

试剂五：液体2.5mL×1瓶，4℃避光保存。

样品处理

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清（浆）：直接测定

操作表（取2 mL离心管，按照下表操作）

	空白管	测定管
样品（μL）		600
H2O（μL）	600
试剂一（μL）	600	600
充分震荡混匀
试剂二（μL）	600	600
10000g，4℃，离心10min，去上清，留沉淀
H2O（μL）	600	600
10000g，4℃，离心10min，去上清，留沉淀
试剂一（μL）	300	300
试剂三（μL）	300	300
充分震荡混匀
试剂四（μL）	300	300
10000g，4℃，离心10min，取800μL上清加入1mL玻璃比色皿
试剂五（μL）	40	40
混匀，25℃静置5min，测定665nm吸光值，记为A测定和A空白，ΔA=A测定-A空白。

H2S计算公式

标准曲线回归方程为：y = 0.0044x，R2 = 0.9988

（1）组织样品

a.按照蛋白浓度计算

H2S（nmol/mg prot）=×V反总÷（V样×Cpr）=340.9×ΔA÷Cpr

b.按照样本重量计算

H2S（nmol/g鲜重）=×V反总÷（V样÷V样总×W）= 340.9×ΔA÷W

（2）液体样品

H2S（nmol/mL）=×V反总÷V样= 340.9×ΔA

(3) 细胞

H2S（nmol/104 cell）=×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量(万个)）=340.9×ΔA÷细胞数量（万个）

V反总：反应总体积，0.9mL；V样：反应中样品体积，0.6mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL

注意事项

最低检出限为1nmol/mL。