注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

DHAR存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR催化GSH还原DHA生成AsA和GSSG，调控细胞AsA/DHA比值，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA含量，进而提高植物食品的营养品质。

测定原理：

DHAR催化GSH还原DHA生成AsA，通过测定DHA减少速率，计算DHAR活性。

实验中所需仪器及设备：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体50 mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体35 mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶（棕色），4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g 4℃离心20min，取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体：直接测定。

DHAR测定操作：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL试剂三、100μL试剂四和700μL 试剂二，最后加100μL上清液，迅速混匀后于265nm比色，记录30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A2-A1。

DHAR活性计算公式：

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

= 92×△A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反总×109÷V样÷T

= 92×△A

ε ：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol /cm；109：摩尔分子换算成纳摩尔分子；d：比色杯光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，1mL=0.001 L；V样：反应体系中加入上清液体积，100μL =0.1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，2 min。

注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的4℃保存，3天内使用完。