LncRNA克隆前的重要预实验
- 是否带有polyA尾
方法：取可能有表达目的lncRNA的总RNA，均分为两份，其中一份以6碱基或9碱基的随机引物进行反转录（命名为cDNA1），另外一份以Oligo dT（15）或Oligo dT（18）进行反转录（命名为cDNA2），转录好的cDNA，按照下列体系，使用基因特异性引物以分别进行扩增、测序，验证目的基因是否表达（建议使用某品牌HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)，货号R133-01*）。
已知基因或LncRNA带有polyA尾的情况下，使用cDNA2的方式进行后续验证试验即可！
*: HiScript 两步法Select RT-qPCR预混液（含gDNA去除模块）以高性价比的HiScript Reverse Transcriptase为基础，针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物，满足多样化的用户需求。可根据逆转录后续实验需要选择Oligo (dT)18primer/Random Hexamers或基因特异性引物（GSP）。产品中的4 × gDNA wiper可在逆转录步骤前快速彻底去除体系中潜在的基因组干扰，5 ×qRT SuperMix 含有反转录反应除引物以外所需的全部试剂且在-20℃不会冻结，使用方便。
PCR扩增酶：
酶——某品牌TransStart® Taq DNA Polymerase（货号AP141）是新型的热启动酶，是利用两种DNA结合蛋白分别与引物和模板高效结合，一种结合蛋白和引物结合，阻止了低温下引物形成二聚体；另一种结合蛋白和模板结合，阻止了低温下DNA聚合酶与DNA模板结合。随着变性步骤的进行，两种蛋白失活，释放的引物与模板参与扩增反应，增强PCR扩增效率和扩增特异性。扩增产物3'端带“A”碱基，可直接克隆于pEASY®-T系列载体中。
PCR扩增体系：
PCR反应组分配制
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组分
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检测样品
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10× STransStart® Taq DNA Polymerase Buffer
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2.5 μL
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dNTP Mix (2.5mM)
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4~5 μL
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GSP1（10 μM）
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0.2 μL
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GSP2（10 μM）
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0.2 μL
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cDNA（试验样）
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1～2 μL
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TransStart® Taq DNA Polymerase
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0.5~1 μL
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PCR-Grade Water
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至50 μL
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如果目的lncRNA带有polyA尾，cDNA1和cDNA2均可获得目的扩增条带，如果经测序验证为目的序列后，这两条基因特异性引物可以用于后续的RACE试验。
如果目的lncRNA不带有polyA尾，仅有cDNA1可以获得目的扩增条带，cDNA2则无扩增产物，如果经测序验证为目的序列后，这两条基因特异性引物可以用于后续的RACE试验。
- 确定目的基因的表达水平
经过上述方式，即可确定lncRNA是否带有polyA尾。使用同一cDNA样品与某一看家基因进行实时定量PCR，确定目的基因的表达水平。
- 上述两个结果对于后续的RACE试验的结果非常重要，建议试剂盒订购前确定相关信息。
RACE cDNA Synthesis Kit简要操作步骤
使用QualitYard™ RACE cDNA Synthesis Kit（QY0011S）进行RNA反转录。
（1）每个样品及对照均在0.2或0.5 mL PCR反应管内添加下列组分：
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制备可同时用于5'和3'-RACE用的cDNA
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13 µL总RNA （总量≤4 µg）
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1 µL SUPERSWITCH™ 3RRT2
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2µL dNTP Mix (10 mM of each dNTP)
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（2）吸打混匀并瞬时离心。70℃孵育5 min，立即冰浴5 min。
（3）瞬时离心使溶液收集于管底。
（4）在离心管中添加下列组分：
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5× First-Strand Buffer
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5 µL
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SUPERSWITCH™ Reverse Transcriptase
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1 µL
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RNase Inhibitor
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1 µL
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SUPERSWITCH™ BufferⅠ
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0.5 µL
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SUPERSWITCH™ BufferⅡ
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0.5 µL
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总体系24 µL（5'-RACE）
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（5）吸打混匀，并避免产生气泡，瞬时离心收集溶液。42℃的空气浴或PCR仪上孵育30 min；
（6）加入1 µL SUPERSWITCH™ 5RRT，并吸打混匀，42℃继续孵育1 h。
（7）72℃PCR仪上加热7 min。将PCR反应管置于冰上终止第一链cDNA合成。反转录产物可同时用于3'和5' RACE。反转录完毕后，立即将cDNA进行每管3 µL的分装，每次进行PCR扩增取3 µL及其整倍数的分装cDNA即可！
所得产品可以在–20℃下保存3个月。
扩增条件为PCR 第一轮94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 ses，50～68（50.2℃、53℃、57℃、59.9℃、64.2℃和67.5℃温度梯度扩增）℃复性30 ses，72 ℃延伸3 min 30 sec（对应扩增产物约为3.5 kb，可酌情增减延伸时间，但务必比预期的时间多1 min，以避免因扩增产物长度增加无扩增产物的问题），41个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。
第一轮PCR产物取5～10 μL于1.5%琼脂糖凝胶电泳，拍照。
扩增条件为PCR，第二轮PCR倍】稀释，进行第二轮100倍【根据产物浓度可以稀释至50～10不同温度下的扩增产物，混合均匀，并进行PCR吸取第一轮94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 ses，50～68（50.2℃、53℃、57℃、59.9℃、64.2℃和67.5℃温度梯度扩增） ℃复性30 ses，72 ℃延伸3min 30 sec，30~33个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。
表1、基因 5' RACE 第一次PCR扩增方案（替代扩增酶全式金的AP141）
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组分
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5'-RACE（μL）
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10×SUPERSWITCH™ Hot Start Buffer
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2.5
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（dNTP Mix2.5 mM）
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2.5
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